崩溃！磷酸化蛋白 WB 太难了，踩坑无数后我总结

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

崩溃！磷酸化蛋白 WB 太难了，踩坑无数后我总结了这 7 条

2022-04-19 16:41 来源: 戴老师的体育课堂

原标题：崩溃！磷酸化蛋白 WB 太难了，踩坑无数后我总结了这 7 条

蛋白磷酸化，是蛋白激酶在靶蛋白的氨基酸残基上添加磷酸基团的一种可逆的翻译后修饰，也是信号转导研究绕不开的话题。

WB 难，一入 WB 深似海，磷酸化蛋白的 WB 检测更是难上加难！因为一旦细胞裂解，就会释放出蛋白酶和磷酸酶，可以降解或修饰蛋白质，从而影响检测结果。怎么搞定？ 别急，告诉你 7 个小妙招：

01 将样品置于冰上，使用预冷的缓冲液

样品处理中使用的设备或缓冲液应在冰上（4 ℃）冷藏保存。尽可能使用预冷的试剂和设备，可以减缓去磷酸化、蛋白水解和变性。

02 使用磷酸酶抑制剂

在裂解缓冲液中加入磷酸酶抑制剂，否则轻者条带不明显，重者没有条带。最好是添加新鲜配制的蛋白酶-磷酸酶抑制剂混和物。

03 将样品储存在上样缓冲液（loading buffer）中

蛋白定量后，将样品与上样缓冲液混合，遏制磷酸酶活性。随后可以将样本等分并储存在冰箱中或加载到凝胶上。

04 避免使用牛奶作为封闭剂

牛奶中含有大量的一种磷蛋白——酪蛋白，会引起高背景。建议使用牛血清白蛋白BSA或无蛋白的封闭剂。

05 使用无磷酸盐缓冲液

为尽量减少非特异性信号，用 TBST 代替磷酸盐缓冲液（PBS）。如果在中间步骤中必须使用 PBS，则应在加入蛋白检测底物前，用大量 TBST 清洗膜，以除去过量的磷酸钠。

06 使用灵敏的底物进行化学发光检测

如需检测一种弱磷酸化的低丰度蛋白，可使用抗体对蛋白进行免疫沉淀获得浓缩的蛋白，并在泳道中上样更多的蛋白，同时使用高灵敏度的底物进行化学发光检测。

07 检测总蛋白含量

为确定 WB 上信号的缺失是由于磷酸化效率低还是磷酸化蛋白分离不充分，同时需要检测总蛋白含量。例如，使用配对抗体检测磷酸化和未修饰的蛋白。

崩溃！磷酸化蛋白 WB 太难了，踩坑无数后我总结

采用 PDGF（50 ng/mL）处理小鼠 3T3 细胞 0～60 min。通过 SDS-PAGE 在 7.5% 凝胶上分离全细胞裂解物的总蛋白，转移至 PVDF 并在 5% 的 TBST 溶解的脱脂奶粉溶液中封闭。分别用含 2 μg/mL 抗 AKT1（NBP2 - 01725）和 2 μg/mL 抗 pS473 AKT1（NB100 - 56749）抗体检测。用化学发光法检测显示信号。

为定量检测磷酸化蛋白，荧光蛋白印迹法不妨一试。双色检测方法可以同时检测相同印迹上的两种抗原，这里用两个不同种属的荧光偶联二抗同时显示磷酸化蛋白和总蛋白（不同颜色），而无需剥离/重新检测印迹或运行单独的凝胶，称为 multiplexing。这种方法使得量化更为准确。

总之，磷酸化蛋白的 WB 与非磷酸化蛋白基本相似，但在样品制备过程中必须谨慎操作，避免去磷酸化。Bio-Techne 旗下的两大抗体品牌 R&D Systems ® 和 Novus Biologicals ® 可提供 1,000 多种用于 WB 检测的磷酸化抗体，扫描二维码，咨询当地经销商，了解更多磷酸化抗体。

此外，磷酸化蛋白检测的方法还有夹心法 ELISA、流式细胞术、ICC/IHC、固相抗体芯片等，应根据实验设计及实际情况选择合适的检测手段（Table 1）。

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内容审核：李芙蓉

项目审核：陆雯芸

题图来源：站酷海洛

参考文献：

[1]. Bass, J. J., et al. (2017). An overview of technical considerations for Western blotting applications to physiological research. Scandinavian Journal of Medicine and Science in Sports

[2]. McDonough, A. A., Veiras, L. C., Minas, J. N., & Ralph, D. L. (2015). Considerations when quantitating protein abundance by immunoblot.American Journal of Physiology - Cell Physiology.

[3]. Murphy, R. M., & Lamb, G. D. (2013). Important considerations for protein analyses using antibody based techniques: Down-sizing Western blotting up-sizes outcomes. Journal of Physiology.