4种常见的病毒灭活试验方法

作者：张馨予

病毒,一类严格的细胞内寄生物。在宿主细胞外环境，病毒既不能独立进行代谢活动，也不能进行繁殖，只能以颗粒形态存在，即病毒体(virion)的形态存在。病毒死亡，由蛋白质外壳的分裂和核酸退化导致的病毒浓度随时间的降低。死亡的病毒不会感染宿主细胞, 因而丧失对人畜健康危害（没有生物活性，不能主动进入细胞，也不能在细胞内进行复制）[1]。清除病毒的方法有很多，按病毒去除/灭活方式的不同，可分为有机溶剂/去污剂（S/D)法、低pH值孵放法、膜过滤法、紫外法、超短时微波加热法、巴氏消毒法和干热法等[24]。下面将介绍一些常见病毒去除/灭活方法。

4种病毒灭活试验方法

图为病毒结构

（出自胡志红、陈新文主编的《普通病毒学》）

2.病毒去除/灭活技术介绍

2.1有机溶剂/去污剂病毒（S/D）灭活法

过去，人们发现甲肝病毒能通过消化道传播，乙肝病毒通常不能通过消化道传播，但是在胆汁分泌障碍人群体内，乙肝病毒能通过消化道传播的概率较高。后来，科学研究发现，这与胆汁能溶解乙肝病毒的脂包膜有关。根据以上原理，通过研究和临床观察发现，使用Triton-X 45这类的非离子型表面活性剂（去污剂）和磷酸三丁酯（有机溶剂）能够有效破坏类似乙肝病毒的类脂膜：类脂从病毒表面脱落，使病毒失去黏附和感染细胞的能力，从而达到灭活病毒的效果，且对蛋白质分子的结构的影响也非常小[4]。这种方法就是有机溶剂/去污剂病毒（S/D）灭活法。

因S/D法具有较高病毒去除作用、蛋白相容性高、易于插入到现有或新开发的纯化工艺中等优点[16]，人们便将这种灭毒方法用于血浆、血液制品和生物制品[8,17,18,19]。S/D法作为血浆病原体灭活技术，是最早得到医疗界的认可，并投入临床中的。因为S/D法满足了以下三点：①能完全有效灭活胞内、胞外病原体及附着在细胞上的病原体；②所选试剂能选择性地进入细胞且不损伤细胞；③经处理后的红细胞不产生新抗原或者抗体，对人体无害。因为S/D病毒灭活处理对多种不同的包膜病毒都能发挥有效的病毒灭活作用,且有良好的临床安全性，因此其通过美国FDA许可,以用于浓缩的人血液Ⅷ因子的病毒灭活,并已广泛用于生物制品的生产[9,10,11,12]。

在使用S/D法时需要注意：①待灭活的制品中，可能存在颗粒性物质会将病毒包裹其中，这会使S/D试剂无法接触到病毒。因此，需要对制品事先进行1μm或更高的精度的过滤以避免这种风险。②加入S/D后制品应充分混匀，如果加入S/D后再进行过滤，应确保过滤后S/D浓度仍在有效范围内。③S/D试剂要能够与混合容器内每一滴制品接触（特别是罐壁、灌顶上附着的制品可能在灭活工艺结束后又滴入罐内），因此通常是将加入S/D后的制品混合均匀后，泵入另外的容器内恒温，执行灭活程序。④病毒灭活间与后面的生产工序间需要分开，以免造成交叉污染。

S/D法缺点也比较明显：这种灭活方法仅对脂包膜病毒有效，对于非脂包膜病毒无任何效果。而且，虽然S/D法现在被广泛应用于临床，但也存在基因毒性、处理物及其衍生物残留﹑灭活后部分凝血因子减低等问题。

2.2低pH孵放技术

低pH孵放法，是一种化学病毒去除/灭活技术，常用于单克隆抗体的病毒灭活工艺。其原理是利用病毒表面抗原在低pH值的条件下，电荷会发生改变，蛋白质的空间结构也会发生不可逆的改变，从而使病毒丧失侵染细胞的能力。简单来说，低pH孵放法是破坏病毒包膜的完整性、阻断病毒与宿主受体结合的途径，使病毒无法感染宿主细胞，起到灭活病毒的作用[20,21,22,23]。

低pH孵放法虽然因其操作过程简单、病毒灭活效果好，成为重组蛋白药物纯化工艺中常用的关键步骤，但低pH环境容易使重组蛋白不稳定，产生聚体、降解等质量问题。相比较而言，由于抗体类免疫球蛋白在低pH环境普遍表现更加稳定，因此低pH孵放法主要应用在IgG类产品。另外，低pH孵放法具有方法简单、经济实惠、容易操作等特点，已被用于伪狂犬病毒、猪细小病毒、流感病毒等病毒的灭活[5,6]。