实验室检测技术在猪伪狂犬病诊断中的应用

作者：张馨予

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伪狂犬病病毒（ADV）属于疱疹病毒科，猪是PRV的天然宿主，PRV的病毒粒子为圆形，由双股DNA和一个封闭的核衣壳组成，病毒具有高度致病性、复制周期短，在神经节内潜伏感染；在自身免疫状良好的情况下，病毒潜伏在神经组织内，不进行复制，无任何临床症状，当机体免疫力低下，病毒开始大量复制，排毒，发病。

处于发病期和康复期的病猪是危险的传染源，主要以神经症状为主，表现出发热、奇痒和脑脊髓炎为特征，多呈爆发流行，引发妊娠母猪流产、死胎等繁殖性疾病。

伪狂犬病最早报道于20世纪初，曾席卷整个欧洲地区，给养殖生产者造成了巨大的经济损失，在20世纪40年代，我国猪伪狂犬病实验室诊断首先在猫身上分离到了伪狂犬病毒，并开始迅速传播。2011年出现了变异毒株，对我国的养猪业造成严重的威胁。很多国家强制免疫伪狂犬病疫苗，同时通过鉴别诊断技术、鉴别野毒感染，淘汰野毒感染的种猪。目前很多欧洲国家已经根除传统的猪伪狂犬病毒，但目前在我国仍频繁发生，并且其中伴随着变异毒株以及其他疾病的混合感染，根除难度较大，因此研制出更加高效的基因疫苗来阻止伪狂犬病的肆意传播尤为重要。

在疾病的控制过程中，单纯的依靠人的感观、感觉来判断临床症状，从而得出主观方面的临床诊断已经越来越不可靠，因此疾病的诊断更需要一种更为科学的，不仅可以定性、而且可以定量的诊断方法，那就是实验室诊断方法。现将猪伪狂犬病实验室常用诊断方法介绍如下：

猪伪狂犬病（PRV）的实验室检测方法

一、血清学诊断方法

1、酶联免疫吸附试验（ELISA）

作为血清学诊断方法中最主要的检测方法，通过在固相载体表面上将抗原抗体免疫反应的特异性和酶化学反应的敏感性相结合而建立的一种血清学检测技术。可用于大批量的样品检测，具有快速、简便、敏感性强、特异性高等特点。协助养殖场用于正确的引种检测，对疫苗的免疫效果进行评估，制定合适的免疫程序，疾病的诊断，疾病风险的预警等方面具有重要的作用。

中和试验（NT）

又叫微量血清中和试验（MSNT），作为PRV病毒检测的经典方法，因其操作繁琐、工作量较大，受技术条件的限制，实际使用较少。

血凝和血凝抑制实验

血凝（HA）和血凝抑制（HI）实验能同时进行大量样品的检测分析，作为病毒学常用的检测方法之一，也在PRV的病毒检测中具有重要的作用，因在实验操作中受许多人为因素和操作技术规范的影响，导致检测的结果不稳定，误差较大，实际使用较少。

胶体金免疫层析技术（GICA）

胶体金免疫层析技术是以胶体金作为示踪物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。该技术分为斑点免疫金渗虑技术和胶体金免疫层析技术。

免疫荧光技术

利用荧光色素对待检抗原或抗体先进行免疫荧光标记，在进行抗原抗体结合实验，对荧光标记物进行追踪。

二、分子生物学诊断方法

1、实时荧光定量PCR法

PCR技术（Polymerase Chain Reaction, PCR），聚合酶链式反应，是集PCR扩增技术、探针杂交技术和荧光共振能量转移光谱技术于一体的新兴技术。目前DNA提取的试剂盒已经普遍，可以方便快速地从病料组织中提取目的DNA，设计伪狂犬病毒的保守DNA序列引物，进行PCR的扩增。对PCR的产物进行标记跟踪，实时监控反应的过程，对动物疾病的检测具有重要的意义，细菌、病毒、支原体、衣原体均可通过PCR技术检测到，具有敏感性强，对致病微生物病毒进行百万倍的扩增，以及在微生物感染的潜伏期即可用PCR的方法检测出。荧光定量PCR检测技术汇聚了核酸的高效扩增，探针技术的高特异性以及光谱技术的高敏感性和高精确定量的优点，通过直接探测PCR过程中荧光信号的变化来获得定量的结果。

2、DNA探针技术

以PCR技术作为基础，将伪狂犬病毒的一段保守片段进行克隆作为探针材料，进行目的基因的扩增。结果准确，灵敏度高，但此方法操作复杂，成本较高。

三、伪狂犬血清学诊断方法与分子生物学诊断方法的比较