单克隆抗体的表征分析有哪些？

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

在销售额方面，连续几年单克隆抗体药物在每年的销售额排名中一直是占据着前几名。有不下几十种新mAb药物产品和mAb生物仿制药正在开发中，并且每一个单抗药物都需要进行广泛详细的表征研究，以获得临床试验所需的批准并最终投放市场。

欧洲药品管理局（EMA）于2009年7月发布了有关mAb表征的监管文件。该EMA指南标题为“单克隆抗体及相关产品的开发，生产，表征和规格”。文件指出，研究者应详细的研究单抗的表征mAb。单抗表征应包括根据国际协调会议（ICH）指南Q6B（3）确定mAb的理化和结构性质，纯度，杂质等方面。

ICH Q6B为生物技术产品的表征提供了一套统一的国际公认原则，以支持单抗药物的市场应用。该文件建议进行分析以提供有关生物或世界杯2022预选赛积分榜产品的以下信息：

结构表征

1 氨基酸序列

2 氨基酸组成

3 末端氨基酸序列

4 肽图

5 巯基和二硫键

6 糖基化结构

理化分析

1 分子量大小

2 异构体

3 消光系数（或摩尔吸收率）

4 电泳图

5 液相色谱图

6 光谱

下面我们一一讨论用于提供这些准则所需数据的分析技术。

氨基酸组成和消光系数测定

ICH Q6B指出：使用各种水解和分析方法确定氨基酸的总含量，并从所需产品或天然对应物的基因序列中推断出氨基酸组成（如有必要）进行比较。在许多情况下，氨基酸成分分析提供了一些肽和小分子蛋白质的结构信息，但是对于大蛋白质来说，这些数据的确定性通常较差。在许多情况下，氨基酸定量分析数据也可用于确定蛋白质含量。

如今，使用反相高效液相色谱（RP-HPLC）和柱前衍生化技术进行氨基酸组成分析，或者采用柱后衍生化处理的离子交换色谱法来确定世界杯2022预选赛积分榜产品的氨基酸组成。如果已知每摩尔蛋白质的氨基酸摩尔比和蛋白质的总分子量，则可以从产物水解物中检测到的每种氨基酸的量而计算蛋白质含量。同样，如果已知溶液的光密度（在280nm处）（用于分析氨基酸的等分试样）是已知的，则根据比尔朗伯定律（吸光度[OD] =ε.cl；其中ε是消光性）系数，c是浓度（M/L）。

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氨基酸序列和多肽测定

对于mAb，EMA指南和ICH Q6B要求通过适当的方法（例如，肽图分析，氨基酸测序，质谱分析）从DNA序列中推导氨基酸序列，并通过实验确认DNA衍生序列。另外，N-末端氨基酸序列（是否存在游离氨基酸或焦谷氨酸）和C-末端氨基酸序列（例如，存在或不存在C-末端赖氨酸）的变异性，重链等）应进行分析。

肽图分析（即使用mAb的特定蛋白酶消化酶，然后使用带有紫外UV和电喷雾质谱检测[LC/ES–MS的在线RP-HPLC分析产品）可提供有关分子量的信息。通过选择的蛋白酶从而使得mAb释放形成肽。获得的数据能够提供（或以其他方式）DNA衍生序列的确认，但不能提供mAb轻链和重链序列的确认。为了在一级氨基酸序列水平上提供确认，需要将许多蛋白酶消化物与在线RP-HPLC和串联MS/MS（LC/ES-MS/MS）分析联合使用。ICH Q6B实际上并不要求在一级氨基酸水平进行测序。但是，某些监管机构已采取了相应的行动规范。

由于质谱的测序无法（在大多数情况下）区分异亮氨酸和亮氨酸（这些氨基酸具有相同的分子量），因此要明确分配这两个氨基酸，就需要对纯化的肽在轻链和重链的可变区内进行自动N端测序。

末端氨基酸序列测定

进行末端氨基酸分析以鉴定mAb轻链和重链的氨基和羧基末端氨基酸序列。如果产品显示一个以上的末端氨基酸序列，则应确定末端的相对量。

使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离轻链和重链后自动进行N末端测序，然后常规地印迹到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，分析mAb轻链和重链的N-末端。自动化的N末端测序使用Edman化学法，在切割N末端和随后的氨基酸之前，需要在蛋白质的N末端具有游离的氨基官能团以进行标记。这意味着对于许多mAb（在N端有焦谷氨酸，因此没有游离氨基），使用此方法的末端测序将不提供序列信息。在这种情况下，焦谷氨酰胺酶可用于在N末端测序之前酶促除去N末端焦谷氨酸残基。