等温扩增技术的原理及应用

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

等温扩增技术（isothermal amplification technology，ITA）是近年来发展起来的基于恒温扩增的新型核酸扩增技术,主要包括环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP) [ 1] 、交叉引物扩增（crossing priming amplification，CPA） [ 2] 、链替代扩增（strand displacement amplification，SDA) [ 3] 、重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification，RPA) [ 4] 、依赖核酸序列的扩增（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA) [ 5] 、滚环扩增（rolling circle amplification，RCA) [ 6] 和依赖解旋酶的扩增（helicase-dependent amplification，HDA) [ 7] 。尽管各种等温扩增技术均采用恒温扩增，但引物设计与扩增原理差异较大，本文就其原理、特点及应用进行综述。

一、LAMP

1．原理：

2000年，日本学者Notomi等 [ 1] 报道了LAMP技术。LAMP在60~65 ℃条件下进行 [ 8] ，需要4条引物和具有链置换功能的嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶（DNA polymerase of Bacillus stearothermophilus，BstDNA聚合酶）。外引物与PCR引物类似，而内引物则含有两段序列。过程如下：（1）内引物结合目的基因，在BstDNA聚合酶的作用下延伸为双链。外引物与双链DNA的5′端结合，在一端形成环状结构。另一端经过同样过程，形成两端为环的哑铃状结构。（2）哑铃状结构的单链DNA具有模板与引物的双重功能，在Bst聚合酶的催化下即能延伸。（3）内引物也能与环状结构结合，在酶的作用下进行延伸 [ 9] 。

2．特点：

LAMP的优点为特异性和灵敏度高；扩增产物可通过电泳、电化学传感器、横向流动试纸条等方法判定结果 [ 10] 。局限性在于引物设计繁琐，易出现非特异性扩增，可通过标准化引物和调整缓冲液浓度克服此缺点 [ 11] 。

3．应用：

LAMP可用于病原体检测，Lin等 [ 12] 利用LAMP技术检测呼吸道样本中的耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌，该方法检测16s RNA基因检测限为10 4 CFU/ml（CFU为菌落形成单位），mecA基因检测限为10 5 CFU/ml；Ulep等 [ 13] 开发了一个基于液滴LAMP的检测平台，定量检测5%稀释血液样本中的O 157 ：H 7 型大肠杆菌，其检测限为10 CFU/μl。改良LAMP用于检测肺孢子虫，与其他常见肺部感染无交叉反应，且比常规PCR灵敏度高1 000倍 [ 14] 。此外，LAMP还可用于人乳头瘤病毒检测 [ 15] 、食品中肠炎沙门菌检测 [ 16] 等。

LAMP还可用于癌症中突变基因的检测，Itonaga等 [ 17] 利用肽核酸-锁核酸（peptide nucleic acid-locked nucleic acid，PNA-LNA）介导的LAMP检测胰腺癌细胞系中的基因突变，可在突变野生比为0.1%的情况下检测突变基因。Raack等 [ 18] 利用肽核酸介导的LAMP分析法，检测经细胞裂解液处理的口腔拭子样本中的基因突变，并显示出比Sanger测序更好的灵敏度。

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二、CPA

1．原理：

CPA在63 ℃左右进行，依赖Bst DNA聚合酶、甜菜碱和交叉引物。根据交叉引物数量的不同，可分为双交叉引物扩增和单交叉引物扩增。

双交叉引物扩增使用两条交叉引物和两条剥离引物。两条交叉引物分别与模板链互补结合后延伸，随后剥离引物在Bst DNA聚合酶的作用下将新合成的单链剥离，最后两条交叉引物在Bst DNA聚合酶的作用下以新生单链为模板合成大量目的片段 [ 2] 。

单交叉引物扩增使用一条交叉引物、两条剥离引物和两条普通引物。首先交叉引物与模板链结合并延伸为双链，而剥离引物在Bst DNA聚合酶的作用下将新链与模板分离；随后普通引物以新链为模板，合成两条不同长度的单链DNA；最后以这两条单链为模板，以交叉引物与普通引物为引物对，形成扩增循环。

2．特点：

CPA最显著的优点是有极高的灵敏度和特异性 [ 19] 。缺点在于引物复杂、假阳性率高。

3．应用：

由于灵敏度高，CPA主要用于微量病原体核酸的检测：Qiao等 [ 19] 采用CPA和免疫印迹法检测葡萄球菌的凝固酶基因，检出限为3 627 fg（1 fg=10 -15 g）；Meng等 [ 20] 采用CPA检测嗜水气单胞菌，检出限约为5×10 3 CFU/g。反转录交叉引物扩增结合核酸检测试纸条还可用于猪流行性腹泻病毒的检测 [ 21] 。

三、SDA

1．原理：

SDA的反应温度约为37 ℃，反应需要限制性核酸内切酶、链置换DNA聚合酶和两对引物，且其中一对引物（P1和P2）含有内切酶识别序列。反应开始时P1和P2与模板链互补结合，在聚合酶的催化下延伸为双链，随后内切酶识别双链两端的酶切位点，切割形成黏性末端。第二对引物结合模板链末端，在聚合酶的作用下合成新链同时置换出一条单链 [ 3] 。

2．特点：