酶联免疫吸附试验检测细胞因子

作者：张馨予

酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）建立于20世纪70年代，是应用最为广泛的非均相酶免疫测定试验，不仅用于细胞因子测定，也可用于可溶性细胞因子受体或黏附分子的测定。

一、基本原理

细胞因子的ELISA检测常采用双抗体夹心的方法进行检测，采用抗同一细胞因子不同表位的两株单克隆抗体，或一个单克隆抗体和一个多克隆抗体。一个抗体用于包被作捕获抗体，另一个抗体标记酶，作为检测抗体。

二、操作步骤

（一）包被

用0.05mol/L碳酸盐（pH 9.6）包被缓冲液将包被抗体稀释至终浓度为5μg/ml，并加至96孔板中，每孔加入100μl，4℃包被14小时。

（二）封闭

用1%BSA或5%小牛血清（PBS稀释）作为封闭液，加入96孔板中，每孔加入200μl，并于37℃孵育2小时。

（三）加样

用PBS配制0.01%Tween 20洗涤液，将96孔板洗涤3次并拍干。然后，依次分别标准品、质控品和加入样品各100μl，于37℃孵育2小时。

（四）加入酶标抗体

用0.01%Tween 20洗涤96孔板3次后，加入适当浓度的酶标抗体100μl，37℃孵育2小时。

（五）加底物显色

用0.01%Tween 20洗涤96孔板3次，向各反应孔加入新配制的TMB底物溶液100μl，于37℃孵育15分钟。

（六）终止反应和结果判定

各反应孔加入2%氟化钠终止液50μl，酶标仪判读结果。

三、注意事项

1. 包被抗体活性要高，否则影响反应敏感性。

2. 酶结合物可进行效价滴定，选择最佳工作浓度。

3. 底物选择灵敏度高的供氢体，如四甲基联苯胺（TMB）、杂环吖嗪（ABTS）、邻苯二胺（OPD）等。

4. 如有条件可选用生物素-亲和素放大系统。

5. 血液标本离体后可导致某些免疫细胞分泌细胞因子，故应立即分离血浆或血清；血液标本凝集或导致某些细胞因子释放，肝素或EDTA抗凝血能更好反应体内细胞因子水平。

6. 标本溶血、微生物污染可影响细胞因子ELISA检测。

四、方法学评价

1. ELISA检测特异性高、操作简便、成本低和易于推广。

2. 可大规模检测，废弃物易处理。

3.缺点是灵敏度较低，不能检测细胞因子活性。