蛋白相互作用研究技术之电泳迁移率改变（EMS

作者：杨超月

RNA与蛋白相互作用是RNA功能研究的焦点问题之一，也是环状RNA研究者接下来经常会遇到的问题。本文将通过解读有关方法学资料介绍一种RNA-蛋白相互作用的验证实验：电泳迁移率改变（EMSA）实验。主要参考2011年发表在 Methods in Molecular Biology上的一篇方法学文章(Maxwell, 2011) 。

电泳迁移率改变实验（Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA）是常用的研究核酸-蛋白相互作用的技术，基本原理是如果核酸分子与蛋白存在相互作用，电泳中会因为两者结合而导致电泳速度变慢，通过杂交实验可以看出具体的变化状态。该实验的操作相对简单，还能进行定量分析，是研究RNA-蛋白相互作用非常有用的技术。

材料与试剂：

常规材料：

重蒸酚（Tris-HCl, pH 8.0）；

氯仿：异戊醇（24:1）；

RNase-Free超纯水；

3M乙酸钠（pH 5.2）；

无水乙醇；

70%乙醇

放射标记RNA制备用试剂材料：

小牛肠磷酸酶（CIP）及10×CIP buffer：0.5 M Tris-HCl (pH 9.0), 100 mM MgCl2, 10 mM ZnCl2, 0.1 M spermidine-HCl

多核苷酸激酶（PNK）及10×PNK buffer：0.5 M Tris-HCl (pH 7.6), 70 mM MgCl2, 50 mM 二硫苏糖醇(DTT)

[γ-32P] 标记ATP

G-25 sephadex 凝胶珠与离心柱 (Amersham Pharmacia)

TE buffer：10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA.

丙烯酰胺母液：acrylamide：bisacrylamide=19:1

10×TBE：0.89 M Tris base, 0.89 M 硼酸, 20 mM EDTA

尿素（分子生物学级）

10% 过硫酸铵(APS)：现用现配

TEMED

Gel loading buffer: 80%甲酰胺, 1×TBE, 10 mM EDTA

溴酚蓝和二甲苯蓝染料

Clear plastic wrap (SaranTM wrap)

Black India ink

RNA洗脱缓冲液：0.3 M乙酸钠, 5 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.1% SDS

磷屏或X-胶片

0.45-μm孔径的针头滤器

EMSA试剂：

Buffer D: 20 mM HEPES (pH 7.0), 0.1 M NaCl, 3 mM MgCl2, 0.4 mM EDTA, 1 mM DTT, 20% 甘油

10×binding buffer：0.1 M HEPES, pH 7.0, 1 M NaCl

10×phosphate dye: 25 mM 磷酸钾 (pH 7.0), 25%蔗糖, 0.1 mg/mL 溴酚蓝

10×phosphate buffer: 0.25 M 磷酸钾 (pH 7.0)

甘油（分子生物学级）

3mm厚度Whatman滤纸

实验方法：

RNase-Free技术要求：

玻璃器皿通过高温消毒方法实现RNase-Free，DEPC处理塑料制品；

实验全程带手套，避免皮肤来源的RNase污染；

避免重复使用枪头；

保持操作台面整洁无尘，移液枪等设备定期清洗；

所有试剂保证无RNase污染；

RNA样品操作要格外小心，尽量低温操作。避免RNA样品接触二价离子，高pH值（>9.0）或长时间高温放置。

酚-氯仿提取RNA：

向样品中加入等体积的苯酚（注意事项1），剧烈震荡混匀；

10000×g 离心 3 min上层水相转移至新的RNase Free的EP管中（注意事项2）；

重新向苯酚中加入等体积的RNase-Free水混匀后离心收集水相；

向两次收集的水相中加入等体积的氯仿，剧烈震荡混匀，10000×g 离心 3 min；

上层水相转移至新的离心管中，加入1/10体积的3 M 乙酸钠（pH 5.2），加入预冷的无水乙醇至终体积比浓度为70%，–20℃ 放置大于 1 h（注意事项3）；

室温>10000×g 离心20 min ，小心去除上清；

用等体积的预冷70%乙醇洗涤沉淀，轻轻颠倒混匀数次，立即室温>10000×g 离心20 min ，小心去除上清；

冻干法或阴凉处晾干，沉淀用RNase-Free水溶解，测量浓度，保存备用（注意事项4）。

放射标记RNA制备：

常见的放射标记的RNA分为全标记和末端标记两种方式。本方法主要介绍末端标记的探针制备与分离纯化的方法（注意事项5）。

探针分子去磷酸基：

在1.5mL的RNase-Free EP管中按下列体积配制反应体系：

RNA探针 20μg

10×CIP buffer 20μL

CIP (1U/μL) 10μL

ddH2O 补充至总体积为200μL

37℃孵育45min。酚-氯仿法纯化RNA样品。沉淀用30μL RNase-Free水溶解，测量浓度，保存备用。

探针末端标记：

在1.5mL的RNase-Free EP管中安下列体积配制反应体系：

CIP-treated RNA (1–2μg) 50–80 pmol

10×PNK buffer 2.5μL

[γ-32P] ATP (1μCi/μL) 8–10μL

PNK (20 U/μL) 1μL

ddH2O 补充至总体积为25μL

37℃孵育1.5h。添加25 μLddH2O，酚-氯仿法纯化RNA样品。沉淀用30μL RNase-Free水溶解，测量浓度，保存备用。

蛋白相互作用研究技术之 电泳迁移率改变（EMS

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