从pKa到流动相pH的科学选择

作者：杨超月

由于Ka的值可以非常小（10-50）或者非常大（1012），范围跨度很大，因此使用起来不方便。为了方便起见，定义了pKa来表示酸的酸性强度：

pKa越小，酸性越强；反之，酸性越弱。pKa的大小和化合物本身的结构有关，也和溶剂有关，比如在水中测到的pKa和在DMSO中测到的就不一样（后面还会详细介绍到当配置流动相时，有机溶剂加入缓冲液后引起pKa和pH的变化）。

相应的，碱性化合物的电离常数为Kb，也有用Kb的负对数pKb表示碱性强度。由于Kb与它的共轭酸的电离常数Ka的乘积为常数，因此一般用它们的共轭酸的pKa表示其酸碱性，其共轭酸的pKa越大，碱性越强，反之碱性越弱。

pH: 氢离子浓度指数，即：

大部分的用反相色谱分析的化合物都具有一些可离子化的官能团，比如羧基（-COOH）、磺酸基（-SO3H）或者氨基（-NH2）。而在反相色谱中，样品的保留情况和其官能团的离子化状态关系密切，中性态和离子态之间的保留时间往往可以有高达30倍的差异。因此如果想要获得好的色谱选择性和保留重复性，对离子化程度的各种影响因素的理解就很重要。

可离子化的分析物的反相保留取决于它们的离子化程度，一般离子化程度越高，在反相固定相（如C18）上的保留越弱，在中性状态时保留最强。而分析物的离子化程度取决于流动相的pH值和分析物的pKa值，因此保留时间也就取决于流动相的pH和分析物的pKa。

对于酸性和碱性分析物，其保留因子和流动相pH的关系图为：

从pKa到流动相pH的科学选择

即酸性条件（低pH值）有利于酸性分析物的保留，而碱性条件有利于碱性分析物的保留。且在pH大于或者小于某个值时，保留因子不随pH的变化而变化，而在这两个阶段中间，保留取决于离子化程度：

这里k表示分析物的保留因子，k0是分析物的质子化（即分子态）时的保留因子；k1是分析物去质子化（即离子态）时的保留因子；d是去质子化的程度：

这个方程里的pH是指流动相的实际的pH，pKa是化合物在这种流动相条件下的pKa。

对于同时带有酸碱基团的化合物来说，两性离子状态（即既带有正电荷，又带有负电荷）的保留比只带有一种电荷时保留要弱，因为其离子化程度更高。比如说对于一些氨基酸，在等电点时保留最弱。这种化合物的保留因子和流动相pH的关系图如下：

从pKa到流动相pH的科学选择

因此可以说，分析物的pKa决定了化合物的保留情况变化的pH范围。如果pH值在化合物的pKa的±2个单位之外，分析物会99%呈现电离态或者未电离态。这意味着这个区间之外保留时间不随pH的变化而变化；然而在这个区间之内，特别是pKa的±1.5个单位之间，保留时间随着pH的变化非常明显，这意味着要获得重复性好的保留时间，在实际操作中对pH进行严格的控制非常有必要。

pKa的确定或预测

既然pKa那么重要，我们怎么才能获得分析物的pKa值呢？

第一，对于已知化合物，我们可以通过一些数据库进行查询。在这里比较推荐两个开放的数据库，一个是英国RSC的，这是一个通用型的数据库，收录的化合物类型也比较广；另一个是针对于药物分子数据的加拿大数据库，只要输入目标化合物的CAS号或者英文名，就很可能可以在这两个数据库上查到相关信息。

第二，假如我们没办法在数据库中查到相关信息，我们可以根据一些已知数据进行预测。对于一些典型的化学物，我们应该熟知它们的pKa。最常见的脂肪族羧酸pKa值约为5，比如布洛芬的pKa为5.2；典型的胺类化合物的pKa约为9，比如阿米替林的pKa是9.4。这样在分析一些酸碱性的问题时就可以信手拈来，方便快捷。如果要尽量准确地预测一个新化合物的pKa，这就是一个比较系统的工程，因为一般一个化合物的pKa除了与它的关键基团如羧基、氨基等有关，还和这些基团所连接的其他结构有关，因此最好以结构尽量类似的已知化合物的pKa为基础进行预测。下面摘取了《Modern Physical Organic Chemistry》中常见结构的酸碱化合物在水溶液中的pKa:

从pKa到流动相pH的科学选择

二、缓冲液

基本概念