白腐真菌Inonotus obliquus降解木质纤维素及菌体蛋白

作者：张馨予

【摘要】：木质纤维素广泛存在于植物细胞中,是自然界中含量最多的有机可再生资源。木质纤维素的降解转化及利用是科学界和工业界的研究热点,而木质纤维素中的木质素由于具有各种生物学中稳定的复杂键型,不易被微生物降解。在反刍动物营养方面,研究者对与人类营养不产生竞争的成分愈发感兴趣。反刍动物是消化植物细胞壁碳水化合物的专家,因此在反刍动物营养方面,木质纤维素生物质有着潜在的应用价值。然而,木质素在生物质中的存在限制了纤维素和半纤维素的有效利用。目前,通常使用物理或化学手段降解木质素,但这需要高昂的设备和有毒的化学药品。而白腐真菌选择性降解木质素的特性,可能是目前物理和化学方法的一个有力替代者。白腐真菌寄生在木质纤维素生物质上,能够产生分解木质素的酶、自由基和其它小分子化合物。虽然对于这些真菌如何降解木质素的机制还不完全清楚,但是真菌菌株、木质纤维素的来源和培养条件对该过程有重要影响。然而,由于缺乏标准化的培养条件,真菌脱木质化的效果难以统一比较得出结论。还有所用真菌菌株的条件和信息,再加上不同研究之间的化学分析和体外降解率测定也都不统一。真正应用在动物体内的研究数量有限,而且大多数只是描述真菌处理生物质后的消化率问题。对真菌预处理的优化应集中在缩短脱木质化的过程,使其更有效的选择性降解木质素。在这方面,今后的研究重点应放在培养条件和基因表达的优化上,以便能够更好地了解所涉及的机制,推动降解生物质木质素的真菌菌株的发展。桦褐孔菌作为一种白腐真菌,不但能够有效降解木质纤维素,还含有许多生物活性物质,例如多糖、多酚、三萜等化合物,因此具有良好的发展前景。本论文首先通过响应面法优化了桦褐孔菌的培养条件,缩短了固体发酵的时间,增加了粗蛋白含量,降低了木质素含量;然后在动态发酵过程中研究了纤维素酶和木质素酶的变化情况,探究了桦褐孔菌降解木质纤维素的机理;再分析了发酵样品的化学成分和营养成分等内容,包括纤维成分、粗蛋白、氨基酸、麦角固醇;最后在体外模拟反刍动物消化饲料的过程,运用体外产气法衡量了发酵后样品的瘤胃消化情况,为生物制秸秆饲料提供了新的方法。研究结果如下所示:1、桦褐孔菌固体发酵麦秆优化后的最佳发酵工艺为:麦秆10 g,玉米粉1 g,水料比2:1,其中营养液的成分为:(NH_4)_2SO_4 1%,MgSO_4·7H_2O 0.03%,KH_2PO_4 0.011%,Tween80 0.4%,pH 7.4,接种量为1 mL,发酵温度为26°C,静置培养12天。麦秆经过优化后的发酵工艺处理,比发酵前麦秆的粗蛋白含量(4.4%)提高了95.5%。2、发酵15天后,羧甲基纤维素酶和滤纸酶都达到最大酶活,分别为10.1 IU/g,2.6 IU/g;木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶的酶活分别在第5天、15天和25天达到最大,依次为1729.0 IU/g,610.3 IU/g和98.0 IU/g。固体发酵过程中,木质素降解酶活力优先达到高活性阶段,用于降解外围的木质素成分,而后纤维素酶发挥作用,产生高活力的纤维素酶,降解利用内部的纤维素和半纤维素。3、固体发酵过程中,粗蛋白含量在第20天达到最高,为10.8%,比未处理的麦秆增加了144.3%,第20天桦褐孔菌的生物量最高,为0.3 g。发酵15天后,生物质的总氨基酸含量增加了25.6%,必需氨基酸含量增加了47.8%,其中苏氨酸增加了74.4%,甲硫氨酸增加了1070.4%,营养价值显著提高。4、在30天的发酵过程中,木质素、纤维素和半纤维素的降解率分别为46.0%,51.3%,42.4%。在发酵的前15天,木质纤维素的3种成分降解明显,质量损失表明桦褐孔菌的生长效果良好。而在发酵后期,降解速率减慢,几种成分基本不再变化,桦褐孔菌进入衰退期。5、瘤胃的体外模拟实验中,体外产气量表明桦褐孔菌处理后的麦秆更有利于反刍动物消化,比未处理的麦秆最高增加了46.0%。而体外消化率的结果不具有规律性,说明动物体内代谢复杂,仅靠消化率难以说明饲料的喂养情况,涉及到的机理需要综合众多因素加以分析。综上所述,桦褐孔菌对麦秆的固体发酵处理不仅使得蛋白质含量显著提高,而且含有多种高活性的纤维素酶、木质素降解酶,多种氨基酸和微量元素,营养成分全面,适口性好,反刍动物消化率高,为麦秆资源的深度利用,提供了新的途径。