NEJM综述：基因编辑治疗的起源、进展和临床试验

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

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2019年3月7日，《新英格兰医学杂志》（NEJM）发表了题为《一类通过DNA编辑发挥作用的新型药物》（A New Class of Medicines through DNA Editing）的综述，介绍了基因编辑的发展，讨论了将其作为治疗手段疗效、特异性、输送和安全性对于所不可或缺的作用。我们在此简介综述中的主要内容。

基因编辑的早期发展

1994年Jasin等发现，用核酸酶使靶基因中的DNA双链断裂，并且在断裂的同时提供供体DNA模板，可以提高基因编辑的效率。这一发现表明可通过同源重组在突变位点插入新序列，同时还表明可通过称为非同源末端连接（NHEJ）的过程在断裂位点产生新突变。DNA中特定的双链断裂可诱导修复这一发现，奠定了基因组编辑领域的基本原理。图1列出了基因组编辑技术及其商业应用的发展时间线。

已经用于基因编辑的核酸酶技术主要有归巢核酸内切酶-兆核酸酶、锌指核酸酶（ZFN）、转录活化因子样效应核酸酶（TALEN）和与Cas9核酸内切酶相关的成簇的规律间隔的短回文重复序列（CRISPR-Cas9），目前应用较为广泛的是TALEN和CRISPR-Cas9系统（图2）。

准确的切割和修复

现在大红大紫的CRISPR-Cas9系统的发现得益于科学家对细菌适应性免疫系统的研究。由于基因组编辑中仅使用细菌系统的两个成分，即Cas9核酸酶（最常用的Cas9酶来自产脓链球菌）和向导RNA（gRNA），因此称该方法为Cas9-gRNA系统更为准确。在基因组编辑中，gRNA与DNA靶位点结合后，Cas9核酸酶受诱导发生构象变化，之后将DNA切割。gRNA序列的设计简单方便，易于优化与特定DNA靶位点的杂交，从而通过DNA碱基配对将Cas9-gRNA“引导”至其靶位点（图2D）。

经过核酸酶切割的DNA必须通过某种机制被细胞修复。基因编辑涉及到的修复机制为非同源末端连接（NHEJ）和同源介导的双链DNA修复（HDR）。

高效的递送系统

为了实现高效编辑，必须在不激活细胞毒性反应的情况下，将足量具有良好特异性的高活性核酸酶输送入细胞核内。对于具有完整的抵抗外源DNA和RNA的原代人细胞，必须以mRNA（进入细胞后被翻译）或核糖核蛋白复合物（例如Cas9-gRNA）的形式输送核酸酶。新型的重组腺相关病毒载体可以在向细胞核输送单链DNA时避免被细胞探测到。电穿孔是离体输送这些分子的一种有效且相对无毒的方法。

一些靶向特定通路的小分子可以增强HDR介导的细胞内编辑。但是，某些干预措施干扰了细胞的正常修复方式或应对双链断裂的方式，从而可能损害对在细胞周期中自然发生的20~40个双链断裂的修复能力。

输送核酸酶过程中的其他方面也需要考虑。例如，虽然在将核酸酶输送至原代人细胞方面，mRNA优于质粒DNA，但mRNA可诱发抗病毒Ⅰ型干扰素应答。此外，核酸酶的长期表达或低特异性核酸酶的表达可激活p53通路，从而触发细胞周期停滞和细胞凋亡。

让细胞变成药物

在所有基因组编辑方法中，目前发展最成熟的是离体基因组编辑，即在体外对细胞进行基因工程改造，然后将细胞回输到患者体内。近年，以中美两国为代表的团队已经开展了一些基因编辑的临床试验，例如：产生更强效的CAR T细胞，用于治疗癌症；敲除BCL11A的红系特异性增强子，以上调自体红系造血干细胞中的γ球蛋白，作为镰状细胞病和β-地中海贫血的潜在疗法。临床前研究提示，针对某些疾病（例如慢性肉芽肿病、X连锁重症联合免疫缺陷、X连锁高IgM综合征和HIV感染）的离体、自体、基于细胞的基因组编辑将取得较好疗效。

目前有14项已结束或进行中的ZFN试验，8项TALEN，以及12项CRISPR-Cas9。大多数有关ZFN的临床前研究已经发表并经过同行评议。

虽然体外细胞编辑已经取得了一定的疗效，但是仍然存在很多局限性，比如尚无将经过基因编辑的细胞移植到肝脏或脑的可靠方法。对于那些无法应用体外编辑治疗的疾病，体内编辑，即将编辑装置输送到患者体内从而在自然条件下对细胞进行编辑，可能发挥重要作用。

但是人体自身免疫系统对体内编辑是一个很大的障碍。所有主要核酸酶平台均包含外源蛋白。因此，长期表达核酸酶可能诱发适应性免疫应答。此外，首剂给药可能导致患者对之后的给药产生免疫力。Cas9-gRNA系统中使用的Cas9核酸酶来自两种细菌（产脓链球菌和金黄色葡萄球菌）中的一种。由于每种细菌均在人群中有普遍感染，因此大部分成人之前就对Cas9有免疫力。

棘手的安全性评估