MET转录物的反义寡核苷酸序列的制作方法

作者：张馨予

用于沉默肿瘤中的人l1-met转录物的反义寡核苷酸序列
技术领域
1.本发明涉及用于沉默肿瘤中的人l1-met转录物的反义寡核苷酸序列。

背景技术：

2.具体而言，本发明涉及使用反义寡核苷酸通过沉默人l1-met来诱导几种类型的人癌细胞死亡，所述人l1-met是在肿瘤细胞中特异性转录的非编码转录物。
3.如今，研究的重点是寻找治疗癌症的新疗法，特别是对癌细胞有选择性的新疗法。
4.事实上，众所周知，化学疗法等抗癌疗法会导致癌细胞和正常细胞均死亡。正常细胞的死亡会导致一些令人不快的副作用。
5.为了解决这个问题，在过去的20年中，人们开发了新的治疗策略来靶向在癌细胞中的表达更多的特定分子。患者个人分子景观(molecular landscape)解决了特定药物的物理问题，减少脱靶。然而，被这种药物靶向的分子不仅存在于癌细胞膜上，还存在于一些正常细胞中。此外，其他基因中突变的存在会导致无效，即在结直肠癌中，kras基因中突变的存在导致使用与egfr结合并阻断该途径的药物无效。在肺癌中，egfr中突变的存在可以导致对egfr抑制剂的更好反应，但是当耐药突变上升时，药物变得无效。
6.鉴于上述情况，因此显然需要提供能够克服已知抗癌疗法的缺点的新抗癌疗法。
7.众所周知，长散布核元件(line-1)是可逆转录转座元件，约占人类基因组的20％。当它们被位于其启动子区域的cpg岛的低甲基化激活时，line-1保留将自身转座到新的染色体区域位点的能力[1]。这些序列中只有少数(通常位于非编码区)具有逆转录转座能力，但通常在几乎整个生命中都保持不活跃[2]。当去甲基化时，line-1启动子可以充当有义启动子，引导两个开放阅读框(orf-1和orf-2)的转录，或充当反义启动子[3]。反义启动子驱动相反链相对于line-1方向进行转录的活性可导致包括邻域序列的转录物的出现[4]。在这方面，最近在line-1序列的5’utr内发现的新的灵长类动物特异性开放阅读框(orf-0)被证明是近端外显子融合转录物的起源，使用两个剪接供体位点[5]。位于人met基因的内含子2内的line-1序列，称为l1-met(图1)，属于灵长类亚科，并且不能逆转录转座。然而，启动子区域已完全保留，因此允许反义启动子通过低甲基化被激活，并产生源自orf-0区域并包含邻域met序列的替代转录物。l1-met转录物于2002年首次被描述[6]，但其全长的表征仅在2018年实现，如miglio等人(2018)所述(图1)[7]。在后一项研究中，显示转录物从orf-0开始并在met 3’utr处结束，包括6个不同的剪接变体，它们来源于两个剪接供体位点与三个不同受体位点的组合，其中两个位于met基因的内含子2中。l1-met转录物的长度和编码开放阅读框的缺失表明它作为长非编码rna的功能。还证明，尽管l1-met不编码功能性蛋白质，但3’utr和polya区域的存在赋予转录物从细胞核转运到细胞质的能力。这个特征连同它的长度，表明它作为长非编码rna的作用。到目前为止，只有两项研究试图研究l1-met的生物学功能。其中，weber等人在通过敲低dna甲基转移酶蛋白来诱导l1-met表达并通过低甲基化促进转录后观察到met蛋白水平降低[8]。另一方面，wolff等人报道了在细胞系中转染l1-met后存在截短的met异构体[9]。然而，在miglio等人,2018[7]中，蛋白质印迹和信息
学预测工具均没有证明截短的met蛋白的存在。

技术实现要素：

[0008]
已经表明，l1-met反义启动子的激活是一种肿瘤特异性机制，因为实验研究和计算机分析都清楚地表明，没有证据表明l1-met在正常组织中表达[7]。
[0009]
根据本发明，现在已经表明，l1-met转录物的沉默导致肿瘤细胞显著死亡，但正常细胞却没有，这表明l1-met是癌症治疗的有希望的靶标。
[0010]
在靶向该序列的可用治疗策略中，主要用于癌症以外的疾病的反义寡核苷酸似乎更合适[10]。
[0011]
特别地，根据本发明，已经表明通过靶向l1-met的特定调节序列的反义寡核苷酸进行的l1-met转录物的沉默诱导不同类型癌细胞的选择性死亡，而未转化的细胞不受影响。这些结果支持使用这些寡核苷酸序列来诱导肿瘤细胞死亡。
[0012]
具体而言，根据本发明，已经鉴定了特定序列，其覆盖met内含子2中的76bp并成为l1-met转录物的一部分。可以有利地靶向该序列以引起人l1-met转录物的早期降解。
[0013]
特别地，根据本发明，已经通过计算机分析鉴定了11种反义寡核苷酸，它们能够选择性地沉默l1-met转录物。此外，其中三个已在体外实验中进行了测试。
[0014]
本发明的反义寡核苷酸可以单独或组合用作药理化合物。
[0015]
因此，本发明的反义寡核苷酸可以有利地用于诱导对l1-met转录物表达呈阳性的人肿瘤细胞的大量选择性死亡。本发明的反义寡核苷酸对肿瘤细胞的高选择性是由于在正常组织中不存在l1-met表达及其通过低甲基化引起的特异性肿瘤转录激活。
[0016]
可以对反义寡核苷酸进行化学修饰，以便在没有载体的情况下将其施用于患者或与载体缀合以提高肿瘤细胞的转染效率。可用于施用aso的载体的实例是脂质体或纳米颗粒，允许更快速的内化，但可能显示出一些限制，例如网状内皮系统的降解。
[0017]
尽管过去反义寡核苷酸表现出一些局限性，主要是由于在血液中的时间短和清除快，但由于引入了化学修饰(即锁核酸
–
lna、硫代磷酸酯骨架、2
’‑
核糖修饰)从而允许直接施用化合物，目前获得了令人鼓舞的结果[11]。这些化学变化增加了与血清蛋白的结合，从而降低了肝脏的清除，并增加了可用于摄取到靶细胞中的时间。在过去几年中，几种反义寡核苷酸已被fda批准用于治疗不同的疾病(即脊髓性肌萎缩症、纯合子家族性高胆固醇血症)。
[0018]
因此，本发明的具体目的是靶向由gcagaaaatgtgctagattggaggtgaagaccctggagccagagagcctaggcttagtcctagccctgcactgaag(seq id no:1)编码的l1-met转录物区域的反义寡核苷酸。
[0019]
根据本发明，所述反义寡核苷酸可以靶向由gcagaaaatgtgctagattggaggtgaagac(seq id no:2)或ttagtcctagccctgcactgaag(seq id no:3)编码的l1-met转录物区域。
[0020]
此外，根据本发明，所述反义寡核苷酸可以包含7至50个核苷酸、优选12至30个核苷酸、更优选15至23个核苷酸的序列。例如，当所述反义寡核苷酸包含去铁核糖核苷酸和核糖核苷酸时，所述反义寡核苷酸可以包含16个核苷酸。
[0021]
根据本发明，所述反义寡核苷酸与l1-met转录物的靶区域互补，并且包含以下或由以下组成：gucuucaccuccaauc(seq id no:4)、gcagggcuaggacuaa(seq id no:5)、
gccuaggcucucuggc(seq id no:6)、cuagcacauuuucugc(seq id no:7)、cuccaaucuagcacau(seq id no:8)、accuccaaucuagcac(seq id no:9)、cuaggcucucuggcuc(seq id no:10)、cuaagccuaaggcucuc(seq id no:11)、gugcagggcuaggacu(seq id no:12)、agugcagggcuaggac(seq id no:13)或cuucagugcagggcua(seq id no:14)，优选seq id no:4或seq id no:5，更优选seq id no:5。
[0022]
根据本发明，可以修饰上述反义寡核苷酸中的一个、多于一个或所有核苷酸，条件是反义寡核苷酸不是仅包含脱氧核糖核苷酸或仅包含具有修饰的脱氧核糖的核苷酸。特别地，核苷酸可以是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、具有修饰的核糖或脱氧核糖的核苷酸。此外，所述核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或具有修饰的核糖和/或脱氧核糖的核苷酸任选地可以具有修饰的磷酸基团。因此，所述反义寡核苷酸中的每一个可以包含核糖核苷酸、核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合、和/或具有修饰的核糖和/或脱氧核糖的核苷酸，其中磷酸基团任选地是修饰的。
[0023]
特别地，修饰的寡核苷酸可以包含具有糖修饰的核苷酸，例如2
’‑
o-moe、2
’‑
o-me、lna、(s)-cet、2
’‑
f rna、吗啉代(pmo)和/或在磷酸基团上具有修饰的核苷酸，例如磷酸二酯(po)、硫代磷酸酯(ps)、二硫代磷酸酯、硫代氨基磷酸酯。磷酸基团的修饰可以应用于任何核苷酸，无论是dna、rna还是在糖上具有修饰的核苷酸。
[0024]
根据本发明的实施方案，反义寡核苷酸可以包括具有lna修饰和硫代磷酸酯(ps)修饰的修饰的核苷酸。
[0025]
根据具体实施方案，根据本发明的寡核苷酸可以包含在分子两端具有lna和ps修饰的侧翼修饰的核苷酸和在分子中心部分的dna核苷酸。这种结构有利地放大了rnase对aso相关靶标的降解。
[0026]
lna修饰有利地增加了与rna靶标的结合特异性，并赋予了对核酸酶的抗性。
[0027]
ps修饰有利地增加了与血清蛋白(白蛋白)的结合，有利于它们在血流中的维持。此外，它降低了肾脏清除，降低了当aso在血流中时肾脏的清除率。
[0028]
此外，上述修饰(lna和ps)的组合提供了改进的转染效率，即使在没有载体(例如lipofectamine、脂质体或纳米颗粒)的情况下也可以进行转染。
[0029]
本发明的另一个目的是一种药物组合物，其包含一种或多种如上定义的反义核苷酸作为活性成分，以及一种或多种赋形剂和/或佐剂。
[0030]
根据本发明，所述药物组合物还可以包含一种或多种抗癌药物。
[0031]
本发明还涉及如上定义的反义寡核苷酸或如上定义的药物组合物，用于治疗表达l1-met的肿瘤，例如三阴性乳腺癌、肺腺癌或结直肠癌。
[0032]
本发明的另一个目的是一种或多种如上定义的反义寡核苷酸与一种或多种抗癌药物的组合，用于在治疗表达l1-met的肿瘤(例如三阴性乳腺癌)中单独或相继使用。
[0033]
根据本发明，“单独使用”被理解为表示以不同的药物形式同时施用根据本发明的组合的两种化合物。
[0034]“相继使用”被理解为表示连续施用根据本发明的组合的两种化合物，每种化合物以不同的药物形式。
[0035]
可用于本发明的反义化合物的具体实例包括含有修饰的骨架或非天然核苷间键的寡核苷酸。具有修饰的骨架的寡核苷酸包括在骨架中保留磷原子的寡核苷酸和在骨架中
不具有磷原子的寡核苷酸。在其核苷间骨架中没有磷原子的修饰的寡核苷酸也可以被认为是寡核苷。
[0036]
在其他寡核苷酸模拟物中，核苷酸单元的糖和核苷间键(即骨架)都被新基团取代。保持碱基单位，用于与合适的核酸靶化合物杂交。一种这样的寡聚化合物，一种已显示具有优异杂交特性的寡核苷酸模拟物，被称为肽核酸(pna)。在pna化合物中，寡核苷酸的糖骨架被含有酰胺的骨架，特别是氨基乙基甘氨酸骨架取代。核碱基被保留并直接或间接结合到骨架的酰胺部分的氮杂氮原子上。
[0037]
进一步的修饰可以包括锁核酸(lna)，其中2
’‑
羟基与糖环的3’或4’碳原子相连，从而形成双环糖部分。该键可以是连接2’氧原子和4’碳原子的亚甲基(-ch2-)n基团，其中n为1或2。
[0038]
其他修饰可以包括2
’‑
甲氧基(2
’‑
o-ch3)、2
’‑
氨基丙氧基(2
’‑
och2ch2ch2nh2)、2
’‑
烯丙基(2
’‑
ch
2-ch-ch2)；2
’‑
o-烯丙基(2
’‑
o-ch
2-ch-ch2)和2
’‑
氟(2
’‑
f)。
[0039]
修饰的核碱基还可以包括其中嘌呤或嘧啶碱基被其他杂环取代的那些，例如7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮鸟苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。一些修饰的核碱基对于增加本发明的寡核苷酸的结合亲和力特别有用。这些包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和n-2、n-6和o-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基-腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。
[0040]
本发明的寡核苷酸可以形成为两种或更多种寡核苷酸、修饰的寡核苷酸、寡核苷和/或寡核苷酸模拟物的复合结构。这种寡核苷酸在本领域中也被称为杂合体或gapmer。
附图说明
[0041]
现在将根据本发明的优选实施方案，特别参考附图，通过说明性而非限制性的方式描述本发明，其中：
[0042]
图1显示了由位于met内含子2内的l1元素产生的l1-met转录物[7]的图形表示。
[0043]
图2显示了反义寡核苷酸沿l1-met的76bp靶片段的作图位点。出于说明目的，该图显示了seq id no:15的核苷酸1-420，以显示seq id no:15中76bp靶片段的位置。
[0044]
图3显示了通过计算机分析预测的三种设计反义寡核苷酸的二级结构。
[0045]
图4显示了l1-met序列的预测的二级结构。反义寡核苷酸的互补区域由粗线突出显示。
[0046]
图5显示了分析的细胞系中l1-met基因的表达水平。
[0047]
图6显示了用l1-met_as1、l1-met_as2和l1-met_as3沉默后分析的细胞系中的l1-met基因表达分析。
[0048]
图7显示了l1-met沉默对细胞活力的影响。
[0049]
图8显示了在癌细胞系中使用l1-met_as1、l1-met_as2和l1-met_as3进行l1-met沉默后凋亡细胞的百分比。
[0050]
图9显示了对l1-met沉默癌细胞的蛋白质印迹分析结果。
具体实施方式
[0051]
实施例1：根据本发明的靶向l1-met的寡核苷酸的计算机识别和表征以及l1-met的体外沉默。
[0052]
材料和方法
[0053]
本研究中使用的人体生物样品属于一名健康供体，他是实验室的内部合作者，并同意采集血液样品并将其用于实验。
[0054]
对于本文所述的实验，没有使用转基因生物(gmo)。
[0055]
癌细胞系
[0056]
mda-mb231和mcf-7细胞系获自nci-60panel，ebc1(cat.jcrb0820)获自健康科学研究资源库(health science research resources bank,hsrrb)，a549(cat.ccl-185)和mrc5(cat.ccl-171)来自美国模式培养物保藏所(atcc)。ebc1和a549在补充有10％fbs的rpmi中生长，对于mda-mb231，使用含10％fbs的高葡萄糖dmem，对于mcf7，使用含10％fbs和10μg/ml胰岛素的高葡萄糖dmem，而mrc5在含有10％fbs的mem中生长。它们的遗传特性通过短串联重复分析(16 hs system,promega,madison,wi)得到证实，最后一次重复是在2019年6月。使用venor gm试剂盒(minerva biolabs，柏林，德国)定期测试细胞的支原体污染。通过使用lympholyte细胞分离培养基(cedarlane)离心从外周血中获得来自健康供体的正常淋巴细胞，然后在补充有10％fbs的rpmi中生长。
[0057]
反义寡核苷酸选择
[0058]
根据先前报道的选择标准[12]，通过计算机分析来选择和研究l1-met转录物的特定76bp序列，以鉴定最佳反义寡核苷酸(aso)。使用五种不同的aso设计工具鉴定了aso最易接近的序列。
[0059]
下面显示了l1-met转录物的完整dna序列(seq id no:15)，其中突出显示了反义寡核苷酸的特定76bp片段靶标(加粗和下划线)。
[0060]
[0061]
[0062]
[0063]
[0064][0065]
查询了五种反义寡核苷酸设计工具，并鉴定了11个能够靶向特定l1-met区域的aso，如下面报告的表1所示。
[0066]
表1
[0067][0068]
aso的大多数定性特征(例如结构、化学和序列组成)强烈依赖于靶标mrna的可及性[13,14]。使用sfold网络工具，然后表征潜在的aso的二级结构，以便检查具有最佳参数的寡核苷酸。此外，还对l1-met二级结构的整个mrna进行了表征，以直观地检查靶标区域的折叠特征。由exiqon(qiagen)(l1met_as1、l1met_as2、l1met_as3)合成的lna-gapmer的特征在于具有两个侧翼rna序列的dna核心区域，包含锁核酸修饰和添加到每个碱基对的磷酸盐骨架。图2显示了aso在76bp序列上的相应位点。
[0069]
瞬时转染
[0070]
根据制造商的方案，在使用lipofectamine rnaimax(thermofisher scientific)用aso瞬时转染之前，所有细胞都在全培养基中培养。作为对照，对乱序的lna gapmer进行转染。转染当天，收获细胞并计数，然后将600,000个细胞/皿接种在10cm组织培养皿中，并在转染混合物存在的情况下使用适当的生长培养基，所述转染混合物由lipofectamine和反义寡核苷酸组成，最终浓度为25nm。转染24小时后，从细胞中提取rna和蛋白质。
[0071]
rna提取和qrt-pcr分析
[0072]
按照制造商的说明，使用maxwell rsc mirna组织试剂盒(promega)从细胞系中提取rna。使用denovix分光光度计进行rna定量。在使用逆转录系统(promega)进行逆转录后，使用定量实时pcr(qrt-pcr)使用先前报道的引物和pcr条件[7]来研究l1-met的基因表达。简而言之，反应混合物由1x缓冲液、2.5mm mgcl2、0.2mm dntp、0.2μm的每种引物、2
×
evagreen染料、0.04u/μl taq聚合酶(promega)和h2o组成，最终体积为25μl，在存在位于l1-met的76bp区域的正向引物和位于met外显子3上的反向引物的情况下。根据以下公式计算相对表达定量(rq)，使用gapdh作为内源性对照：rq＝2-(δct)，其中δct＝(ct l1-met-ct gapdh)。
[0073]
rnaseq分析
[0074]
对a549、ebc1、mdamb-231和mcf7癌细胞系的基因表达谱进行了rna-seq分析。详细地，在三个独立的复制实验中分析了从用l1-met_as1或用乱序的gapmer处理的细胞中纯化的rna，总共24个样品。所有文库制备均使用truseq链式mrna试剂盒(illumina)进行，从1μg rin》8的总rna开始。简而言之，按照低样本工作流程，在纯化poly-a rna(例如mrna)后使用附有poly-t寡核苷酸的磁珠合成cdna，随后对cdna进行末端修复并在3’端进行腺苷酸化，以允许连接索引接头。然后将池化(pooled)文库加载在illumina nextseq 500/550仪器上至最终浓度为1.1pm，用于单端75bp测序。丢弃根据标准illumina nextseq500程序未通过过滤器的读长(reads)。将通过过滤器的读长与grch38初级组装基因组进行比对，所述grch38初级组装基因组使用star(版本2.5.4a，自定义参数
‑‑
outfiltermultimapnmax 10
‑‑
outfiltermultimapscorerange 1
‑‑
outfiltermismatchnmax 999
‑‑
outfiltermismatchnoverlmax 0.08)[16]从gencode(版本29)[15]下载。对于基因表达定量，使用subread featurecounts v1.6.3将读长分配给外显子，丢弃多重映射读长和模棱两可的读长并总结基因名称[17]。使用gencode基本注释(版本29)作为参考转录物注释，并辅以miglio等人,2018[7]中描述的l1-met转录物的自定义轨迹。相同的补充转录注释用于构建star索引。
[0075]
蛋白质提取和蛋白质印迹分析
[0076]
使用热裂解方案在转染24小时后从细胞系中提取蛋白质。细胞用pbs洗涤3次，然后加入由1m tris-hcl ph6.8、10％sds和h2o组成的裂解溶液以达到最终体积。将裂解物收集在1.5ml管中并在95℃下孵育15分钟。在超声处理和16,000g离心5分钟以消除细胞碎片后，使用分光光度计和pierce bca蛋白质测定试剂盒(thermofisher scientific)对蛋白质进行定量。通过sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳(bolt 4-12％bis-tris plus凝胶)(thermofisher scientific)分离50ng蛋白质，并在trans-blot turbo硝酸纤维素膜(bio-rad)上进行印迹。根据使用的抗体，用含有10％bsa或5％脱脂乳粉的tbs-t封闭膜45分钟。
之后，将膜与以下抗体在4℃下孵育过夜：抗akt(2972)、抗p44/42mapk(9102)、抗磷酸化akt ser473(9271)、抗磷酸化-p44/42mapk thr202/tyr204(9101)、抗磷酸化egfr(3777)、抗磷酸化met(3077)(cell signaling technology)；自制的抗met(dl21)和抗egfr(1005sc-03)(santa cruz)。所有一抗均按1:1000稀释。使用clarity western ecl substrate(bio-rad)使用适当的hrp偶联二抗(1:10000-jackson immunoresearch laboratories,inc.)进行化学发光检测。
[0077]
细胞活力和细胞凋亡测定
[0078]
使用cell titer glow试剂盒(promega)评估细胞活力。转染进行了六次实验，每种gapmer为25nm，在96孔板中进行，其中接种了3000个细胞/孔。使用tecan spark 10m仪器(tecan)在转染24小时后获取发光。
[0079]
通过细胞荧光计使用碘化丙啶和膜联蛋白(annexin)v apc缀合(thermofisher scientific)进行细胞凋亡测定。如上所述，将细胞转染在10cm平板中。转染24小时后，用胰蛋白酶分离细胞，用pbs洗涤3次，并在结合缓冲溶液(0.5m hepes、0.15m nacl、0.005m cacl2)中使用膜联蛋白v细胞凋亡检测试剂盒apc(thermofisher scientific)与膜联蛋白v apc缀合和碘化丙啶一起孵育。使用summit v4.3软件(dako colorado,inc.)在cyan细胞荧光计(beckman coulter)上进行采集以分析数据。凋亡指数表示为凋亡细胞的百分比，并使用以下公式计算：(n.早期凋亡细胞+n.晚期凋亡细胞)/检测到的总细胞。
[0080]
l1-met的沉默
[0081]
靶向l1-met的aso的计算机表征
[0082]
如上所述，由序列gcagaaaatgtgctagattggaggtgaagaccctggagccagagagcctaggcttagtcctagccctgcactgaag(seq id no:1)编码的l1-met转录物的特定76bp区域被鉴定，然后检测到它可能更容易接近的部分。考虑到所有经过训练的算法，揭示了2个“aso热靶标”区域，位于l1-met特定区域的边缘。按照上面对seq id no:15报告的编号，在核苷酸+236和+266之间检测到37％的预测的反义寡核苷酸，代表特定区域的前31个碱基和在相同序列的末端(核苷酸+289和+311之间)的36％的预测的aso。因此，检测到的“aso热靶标”区域是gcagaaaatgtgctagattggaggtgaagac(seq id no:2)和ttagtcctagccctgcactgaag(seq id no:3)。
[0083]
只有3个预测的aso覆盖了包含在+267和+288之间的核苷酸位置。为了完成aso评估，应用网络软件sfold的工具srna来预测设计的反义寡核苷酸的二级结构，以确定它们的热稳定性水平。从文献中得知，高速自折叠aso可以被认为是效率较低的，靶结合的增加与形成二级结构的可能性降低有关。因此，为了定义aso的功效，计算了吉布斯自由能(δg)。δg代表通过折叠完全展开的分子而释放的能量。较低水平的δg适用于潜在的高速自折叠分子，而单个aso的核苷酸产生的氢键越少，aso越不容易形成二级结构。在这种情况下，更稳定的反义寡核苷酸(例如，具有正值δg)可以被认为是最有效的。在文献中，定义了δg≤-1.1的截止值。此外，由aso和靶mrna形成的异源双链也取决于转录物的二级折叠。长尺寸的rna分子总是超折叠，与小的aso相反，据报道具有二级结构的区域更容易杂交，特别是当位于序列的末端时。为了检查l1-met整个序列折叠，查询了sfold网页中的srna算法。在表2中报告了所有11个靶向l1-met的预测的aso以及相关的δg值。
[0084]
表2
[0085]
[0086]
[0087][0088]
为了评估l1-met沉默的效果，exiqon被委托设计三种不同的aso，其覆盖两个热点区域，并且还覆盖76bp区域中间的核苷酸，预计这些区域不太容易接近；详细地说，l1-met_as1(seq id no:4)与核苷酸+251和核苷酸+266之间的区域互补，l1-met_as2(seq id no:5)覆盖+289和+304之间的序列。第三个aso(l1-met_as3(seq id no:6))与序列的更中心部分(在+273和+288之间)重叠。图3表示本发明aso的二级结构：除了两个低折叠分子(l1-met_as1/2)外，l1-met_as3仅呈现37.5％的非结合碱基，具有清晰的发夹结构。至于δg，l1-met_as3被确认为最负值(δg＝-2.7)，l1-met_as2的δg＝0.6。至于该特征，l1-met_as1被评估为设计更好的aso(δg＝2.5)。图4总结了l1-met的二级结构的研究结果。第一个a图显示了二级结构的圆形图：l1-met由超过5000bp组成，因此该图对二级结构进行了程式化。特定靶序列包含在图的下半环中，其在图4b中被放大。更详细地，在图c中，报告了76bp特定序列的放大二级结构。3个设计的aso的补充部分被圈出。所有靶标区域均呈现内部环(l1-met_as1和as2)或发夹(l1-met_as3)，证实了预测结果。然而，l1-met_as1和as2靶向最有利的区域，其特点是具有自由末端的二级结构。总之，将所有先前的数据放在一起，不考虑δg，l1-met_as3被包括在内，但潜在活性较低。
[0089]
如表2所报告的，计算了所有其他预测的aso的δg，尽管还有其他aso具有更好的δg，但由exiqon设计的三个用于本文所述的实验，因为它们是使用自己的设计工具产生的。然而，不排除本发明中报告的其他aso的效率。
[0090]
基因表达分析
[0091]
l1-met的沉默是通过转染具有可变l1-met和met mrna表达的细胞系进行的。在肺癌(ebc1,a549:l1-met+/met+)和乳腺癌细胞(mda-mb231:l1-met
±
/met+；mcf7:l1-met+/met-)中进行了实验。此外，未转化的成纤维细胞，即mrc5，和从健康供体获得的来自外周血的正常淋巴细胞也用作正常对照。发现l1-met表达在ebc1、a549和mcf7中通常较高，在mda-mb231中较弱，而在mrc5和正常淋巴细胞中未检测到转录(图5)。转染24小时后，qrt-pcr显示l1-met在所有癌细胞系中的基因表达降低，但在正常细胞(mrc5和淋巴细胞)中没有降低，证实了沉默的功效。如图6所示，观察到三种gapmer的沉默效应降低，其中l1-met_as2最有效，其次是l1-met_as1。如上所述，l1-met_as3对于沉默l1-met转录物的效果较差。
[0092]
细胞活力和细胞凋亡测定
[0093]
为了研究l1-met沉默的生物学效应，进行了细胞活力测定。当用l1-met_as2(p《0.0001)和l1-met_as1(ebc1 p《0.0001和a549 p＝0.0001)处理时，在ebc1和a549细胞系中观察到活力显著降低，而只有用l1-met_as3处理的ebc1显示与对照相比的较低细胞活力(p＝0.002)(图8)。l1-met_as2对mda-mb231(p《0.0001)和mcf7(p＝0.028)有显著影响。正如预期的那样，对照细胞的活力不受三种gapmer沉默的影响(图7)。
[0094]
最后，使用流式细胞仪对癌细胞进行的细胞凋亡评估显示，在使用l1-met_as1或l1-met_as2寡核苷酸进行l1-met沉默后，ebc1和a549细胞出现显著的细胞死亡。l1-met_
transcription of adjacent cellular genes.mol cell biol,2001.21(6):p.1973-85.
[0105]
5.denli,a.m.,et al.,primate-specific orf0 contributes to retrotransposon-mediated diversity.cell,2015.163(3):p.583-93.
[0106]
6.nigumann,p.,k.redik,k.matlik,and m.speek,many human genes are transcribed from the antisense promoter of l1 retrotransposon.genomics,2002.79(5):p.628-34.
[0107]
7.miglio,u.,et al.,the expression of line1-met chimeric transcript identifies a subgroup of aggressive breast cancers.int j cancer,2018.143(11):p.2838-2848.
[0108]
8.weber,b.,s.kimhi,g.howard,a.eden,and f.lyko,demethylation of a line-1antisense promoter in the cmet locus impairs met signalling through induction of illegitimate transcription.oncogene,2010.29(43):p.5775-84.
[0109]
9.wolff,e.m.,et al.,hypomethylation of a line-1promoter activates an alternate transcript of the met oncogene in bladders with cancer.plos genet,2010.6(4):p.e1000917.
[0110]
10.crooke,s.t.,molecular mechanisms of antisense oligonucleotides.nucleic acid ther,2017.27(2):p.70-77.
[0111]
11.shen,x.and d.r.corey,chemistry,mechanism and clinical status of antisense oligonucleotides and duplex rnas.nucleic acids res,2018.46(4):p.1584-1600.
[0112]
12.di fusco,d.,et al.,antisense oligonucleotide:basic concepts and therapeutic application in inflammatory bowel disease.front pharmacol,2019.10:p.305.
[0113]
13.bo,x.,et al.,selection of antisense oligonucleotides based on multiple predicted target mrna structures.bmc bioinformatics,2006.7:p.122.
[0114]
14.shao,y.,y.wu,c.y.chan,k.mcdonough,and y.ding,rational design and rapid screening of antisense oligonucleotides for prokaryotic gene modulation.nucleic acids res,2006.34(19):p.5660-9.
[0115]
15.frankish,a.,et al.,gencode reference annotation for the human and mouse genomes.nucleic acids res,2019.47(d1):p.d766-d773.
[0116]
16.dobin,a.,et al.,star:ultrafast universal rna-seq aligner.bioinformatics,2013.29(1):p.15-21.
[0117]
17.liao,y.,g.k.smyth,and w.shi,featurecounts:an efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features.bioinformatics,2014.30(7):p.923-30.