干货！专家谈细胞株开发的4个关键步骤

作者：张馨予

细胞株开发（Cell line development，CLD）的过程与生物药开发的早期所涉及过程有所不同。创建稳定的用于生产的高产细胞株的步骤包括：宿主细胞株选择，表达载体工程，转染，克隆和细胞扩增，以及各种筛选步骤，从而选择细胞活力高，生长能力强，并且表达水平、以及表达的稳定性、质量情况都具有最高表现的单克隆细胞株。这一过程，不同的企业平台也可以采用许多不同的策略来优化其工作流程，而其中的筛选过程直接决定了细胞形成优质单克隆细胞株的水平，因而显得尤为重要。

干货！专家谈细胞株开发的4个关键步骤

Jon Dempsey博士，Pathway Biopharma的首席执行官兼创始合伙人。Jon博士在世界杯2022预选赛积分榜行业工作了近30年，在生物化学，制造和控制（CMC）方面拥有专业知识，包括细胞系开发，细胞疗法和工艺开发，分析和蛋白质化学，CDMO选择和制造。并参与了几种生物疗法的商业开发。

一些经验丰富的专家，也对此有着深刻的见解。来自Pathway Biopharma的CEO Jon Dempsey博士指出，由于CLD和首批临床药物的开发正处于将新型疗法推向临床试验的关键阶段，因此公司正在寻求采取一切可能的措施来加快开发过程。如果今天我要构建CLD系统，那么我将首先谈到以下四个阶段：

1. 工作流程的制定，然后在过程中使用定向进化或克隆选择来设计适合此工作流程的细胞系。
2. 使用合成载体技术，从而促进表达。
3. 运用自动化平台Cyto-Mine®，消除单轮细胞克隆的过程，从而消除手工流程，加速进程。
4. 减少细胞倍增时间，使工作尽可能的聚焦于细胞快速生长。

制定工作流程并选择合适的细胞系

目前，几乎所有抗体药的生产都来自于中华仓鼠卵巢（CHO）细胞，这一细胞系也是重组生物药主要使用的细胞系，符合FDA批准的监管途径，因此这一细胞系也有助于后续相关药物的上市流程。另外，CHO还符合悬浮培养，可在无血清，无动物来源的化学成分的明确培养基中生长，可实现大规模生产及具有更高的重现性。另外，CHO细胞提供了“人样”糖基化特征，可以阻止患者免疫反应的激活，从而导致不良副作用或产品功效丧失。

在CLD的过程中，定向驯化提供了一种更有效的方法来生成改良的哺乳动物细胞宿主，可用于优化CLD过程。定向驯化可能涉及富集和分选细胞系，以分离出表现出所需生产特性的亚克隆，然后将这些亚克隆用作宿主亲本细胞系，以确保它们能够在发育过程中生长（图1）。

干货！专家谈细胞株开发的4个关键步骤

图1：定向驯化过程

运用合成启动子的载体

表达载体实质上是一段DNA，例如包含了抗体基因和选择标记基因，以及允许在CHO细胞中表达的基因之类元件的一段DNA序列。选择标记基因的主要目的是加快遗传载体在宿主细胞系中的表达。用于CHO细胞的经典选择标记包括谷氨酰胺合成酶（GS）和二氢叶酸还原酶（DHFR）。通常，选择标记基因由最常见的病毒或内源启动子调控。但是，病毒和内源性启动子可能具有不可控或者是无法预测的功能和风险。而这对于工业规模的流程来说并不理想。因此，合成启动子优化蛋白表达的探索成为了新的契机。而合成启动子与病毒启动子相比，具有可预测的功能，并提供更多的转录控制，以促进世界杯2022预选赛积分榜生产的研发。例如，可以设计CHO的在基因治疗疫苗中作用不同的启动子。每个启动子仅在特定条件或位置，例如特定的组织条件下实现表达。

用自动化平台代替手动的筛选流程

传统的方法，往往采用手动的有限稀释法进行筛选。这种劳动密集的过程依赖于液体稀释以及显微镜目测筛选来鉴定和选择单个细胞。尽管这一方法温和直接，但通量低，操作复杂的流程也极易造成污染。由于有限稀释依赖于统计分布，因此这种迭代克隆筛选技术至少需要两轮才能提高单克隆性，并且需要花费大量时间。为了解决这个问题，一些公司只对早期试验进行单轮克隆，如果药物不成功，则将不会进行第二轮的单克隆筛选。

一些团队也开发了其他的平台用于单克隆的筛选，例如目前比较流行的流式细胞分选方法，通过荧光检测细胞表面蛋白的表达水平，进而分离细胞。但这一方法不仅操作复杂，并且流式分选还会带来高剪切力，以及本身无法检测外泌型蛋白。这一系列的技术限制，往往也会在分选过程中，对细胞造成不可逆的损伤，影响细胞的活力和完整性。近年来，一些自动化单克隆挑选成像平台，例如ClonePix，确实也可以解决以上面临的诸多问题。但也引入了假阳性这一难以解决的新问题。