急性单核细胞白血病细胞系

作者：杨超月

THP-1细胞系是从一名患有急性单核细胞白血病的1岁小男孩的外周血中分离得到的，自1980年建系以来，THP-1细胞被广泛用于单核细胞和巨噬细胞相关的机制、信号通路以及营养和药物运输等研究中。相对于U937、HL-60、ML-2等白血病细胞系，THP-1更有类似人原代单核细胞的形态和功能特征（包括细胞分化标记）。相对于人外周血单核细胞（PBMC），THP-1更易在实验室中培养和扩增，且具有更稳定的基因背景，不存在PBMC的个体差异性问题，利于实验结果的重现。因此，THP-1是各大实验室常用的急性单核细胞白血病细胞系，是研究免疫和炎症的理想工具。

基因敲入：

CRISPR-U基因敲入THP-1细胞：

通过核转染法将gRNA、Cas9和Donor共转入细胞中，gRNA和Cas9复合物造成靶位点DNA双链断裂后，细胞以携带敲入片段的Donor作为模板进行同源重组修复（HDR），将敲入片段重组到基因组靶位点。

CRISPR-U可以通过核转染法高效地将CRISPR/Cas9以及Donor载体共转入THP-1细胞中，筛选后挑选单克隆培养。选择不同的克隆分别进行靶位点扩增及测序，筛选出成功敲入的阳性克隆。若敲入的是荧光蛋白等报告基因，也可以通过直接观察荧光进行初步筛选。

应用案例：

通过建立基因敲除和敲入的THP-1细胞模型，明确胞内抗病毒反应的信号通路

DNA通常定位于细胞核中，而异常定位在胞浆中的DNA与通常与病毒感染或肿瘤发生有关。cGAS-cGAMP-STING信号通路可检测胞浆dsDNA的存在，并诱导强效的免疫反应，产生干扰素和激活其他免疫应答基因。与之对应的，RIG1-MAVS可以检测胞浆内的pppRNA（一类dsRNA，某些病毒的基因组），并诱导免疫应答。有时候胞浆内会出现RNA和DNA的杂交复合物，这种分子通常在某些病毒感染的情况下出现。为了研究这种RNA-DNA复合物是通过哪个通路激活免疫应答，研究者分别构建了MAVS、cGAS、STING敲除的THP-1细胞，分别将dsDNA、pppRNA、RNA-DNA复合物导入细胞，发现RNA-DNA复合物是通过cGAS-cGAMP-STING通路进行免疫激活。

随后，研究者通过CRISPR/Cas9技术将2A-GLuc敲入到IFIT1基因座，使其受IFIT1的启动子驱动表达，IFIT1是一个典型的干扰素激活表达的基因。后续实验显示，导入RNA-DNA复合物后，由于干扰素的表达，激活了IFIT1启动子驱动GLuc的表达。这些结果进一步证明了胞浆的RNA-DNA复合物是通过cGAS-cGAMP-STING信号通路激活免疫反应，为抗病毒研究提供了思路[5]。

CRISPR-U可以通过使用通过核转染法高效地将gRNA、Cas9和Donor共转入THP-1细胞中，筛选后挑取单克隆培养。选择不同的克隆分别进行靶位点扩增及测序，筛选出基因敲入的阳性克隆，构建符合您特定研究需要的基因敲入细胞系模型。

参考文献：

Mankan A K, Schmidt T, Chauhan D, et al.Cytosolic RNA: DNA hybrids activate the cGAS–STING axis[J]. The EMBOjournal, 2014, 33(24): 2937-2946.