多重PCR扩增品牌企业「友名生物」

作者：杨超月

出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。

引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。

靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。

反向PCR( Inverse PCR, IPCR术

原理:反向PCR是克1隆已知序列旁侧序列的一种方法，主要原理是用一种在已知序列中无切点

的限制性内切酶消化基因组DNA.后酶切片段自身环化.以环化的DNA作为模板，用一对与已

知序列两端特异性结合的引物，扩增夹在中间的未知序列。该扩增产物是线性的DNA的部分片段，大

小取决于.上述限制性内切酶在已知基闲侧翼DNA序列内部的酶切位点分布情况。用不同的限制

性内切酶消化，可以得到大小不同的模板DNA，再通过反向PCR获得未知片段。

该方法的不足是:①需要从许多酶中选择限制酶，或者说必须选择一种合适的酶进行酶

切才能得到合理大小的DNA部分片段。这种选择不能在非酶切位点切断靶DNA。②大多数有

核基因组含有大量中度和高度重复序列，而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有时也

会有这些序列，这样，通过反向PCR得到的探针就有可能与多个基因序列杂交。

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