基因工程的基本操作程序（基因工程的应用ppt）

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

专题一基因工程

基因工程（原理：基因重组）：（DNA重组技术）按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组技术和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。

一、基因工程的基本工具

（一）限制酶

1、来源：从原核生物中分离提纯。

2、功能：能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。

3、切割结果：（粘性末端和平末端）

【注】双酶切：

（1）防止目的基因和质粒自身环化。

（2）保证目的基因和质粒按照顺利连接。

（二）DNA连接酶

1、种类：

2、功能：将两条DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。

【注】限制酶和DNA连接酶都作用于磷酸二酯键，而不是氢键。

（三）载体

1、结构：例如质粒（见右图）

2、载体需要具备的条件

（1）能在宿主细胞内大量复制并稳定遗传。

（2）具有一个至多个限制酶酶切位点，以供外源DNA片段（即目的基因）插入其中。

（3）有特殊的标记基因（例如抗生素抗性基因），供重组DNA的鉴定与选择。

3、常用载体：（1）大肠杆菌的质粒（天然质粒经过人工改造）。

（2）噬菌体衍生物和动植物病毒。

【需要通过载体而不能直接将目的基因导入受体细胞的原因：基因表达载体包括复制原点、启动子、终止子等结构，而目的基因没有。】

二、基因工程的基本操作程序

（一）目的基因的获取

1、目的基因：为了获得预期性状，需要从供体细胞中获得的基因，主要指编码蛋白质的结构基因，也可以是一些具有调控作用的因子。

2、

（1）基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储备。各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。

【注】：真核细胞的基因有内含子和外显子（如图）

（2）PCR技术

【前提：要有一段已知目的基因的核苷酸序列（目的是为了设计引物）】

①原理：DNA双链复制（生物体外复制特定DNA片段的技术）

②材料：模板、原料（四种脱氧核苷酸dATP、dGTP、dCTP、dTTP）、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）、引物（成对存在）

③扩增过程：

a.变性（90-95℃）：使DNA片段双链解开。

b.复性（55-60℃）：又称为退火，使连接DNA两条单链分别与相应的引物结合。

c.延伸（70-75℃）：热稳定DNA聚合酶催化引物起始合成子链。

④PCR技术与DNA复制的比较

DNA体内复制 PCR技术

解旋方式解旋酶催化 DNA在高温下变性解旋

场所细胞内体外

酶解旋酶、DNA聚合酶热稳定DNA聚合酶

温度细胞内温和条件需要控制温度

合成对象 DNA分子 DNA片段或基因

（二）基因表达载体的构建——基因工程的核心

1、目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。

2、基因表达载体的组成：（如右图）

（1）插入基因：即目的基因

（2）启动子：一段特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录。

（3）终止子：一段特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端，使转录在需要的地方停止下来。

（4）标记基因：用于鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素抗性基因、产生特定颜色表达产物的基因、发光基因等。

（5）复制原点：载体在受体细胞中复制的起点。

3、基因表达载体的构建过程：（如右图）

4、基因表达载体去向：

（1）留在受体细胞中进行自我复制。

（2）整合到受体细胞染色体DNA上。

（三）将目的基因导入受体细胞

1、转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。

2、（1）受体细胞为植物细胞

①农杆菌转化法：目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→农杆菌→农杆菌侵染植物（双子叶植物受伤后产生酚类物质，吸引农杆菌进入植物细胞）细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达。

【原理：目的基因随农杆菌中Ti质粒上的T-DNA转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上】

②基因枪法：利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入到受体细胞中。

③花粉管通道法：在植物受粉后，花粉管未愈合时，剪去柱头，滴加含有目的基因的DNA。

（2）受体细胞为动物细胞