通过稳产HEK293SF细胞系实现慢病毒载体的放大生产

作者：杨超月

慢病毒载体（LV）提供了许多有价值的特性，包括稳定的将基因整合到宿主基因组中，通过VSV-G假型分型将遗传信息转移到分裂和非分裂细胞以及广泛的组织趋向性能力。目前正在临床试验中用于治疗罕见和更频密的遗传和后天疾病，以及CAR-T细胞癌症治疗。

慢病毒载体通常是通过多质粒瞬时转染HEK 293贴壁细胞株而产生，此细胞株通常培养于含血清的培养液中。然而这种方法是实验室密集型，需依赖质粒的供应，不能直接放大。贴壁培养需通过增加细胞附着和生长的可用面积来放大。由于瞬时转染中过量的质粒和转染试剂的残留，会引起终产物的污染。因此，稳定的慢病毒载体生产细胞株运行而生。目前已成功的构建方法是通过诱导系统来避免细胞毒素蛋白（Gag，Rev和VSV-G）的持续表达而引起的细胞凋亡。用于稳定生产的贴壁细胞株已被广泛报道，但却限制了放大和大规模生产。通过高度强化的贴壁培养物，及一次性固定床生物反应器，已解决部分病毒放大培养。与此同时，一些学术和工业实验室正在开发悬浮培养工艺，最终可实现在传统的搅拌罐中完成慢病毒载体的生产。

根据近期文献报道，该领域正在向应用悬浮工艺生产慢病毒载体的方向发展。事实上，在治疗中应用的慢病毒载体，需要以可再生的方式生产足够数量的临床和商业品质的病毒。根据应用和疾病，每名患者需要1-40 × 10 9个感染单位的载体; 不仅增加了经济压力，还需要开发高产量的生产工艺。

在本研究中，我们提出了一种生产慢病毒载体的方案，它使用的是一种稳定的可诱导的生产细胞系，并且该细胞系为我们之前描述的并且在无血清培养基中悬浮生长的包装细胞系。在添加cumate和多西环素后，可诱导包装慢病毒载体所必需组件的基因表达。由于慢病毒载体的稳定性差，我们开发了一种在灌流模式下的生产工艺，并评估了两种方案的差异。

2.材料和方法

2.1 细胞培养

本研究所述的实验中，HEK293SF-LVP-CMVGFPq-92细胞系（简称clone 92）生长和维持在SFM4TransFx293 (Hyclone)或者iHyCell™ TransFx-H media (Hyclone)培养液中，并且两种培养液均添加4mM L-谷氨酰胺。泊洛沙姆188是一种适用于高剪切力环境中的保护剂，并且在HyCell™ TransFx-H培养液中添加0.1%泊洛沙姆188。Cell Boost 5™（CB5）补充剂（3.5 g / L）（Hyclone）是一种化学成分的增强剂，只有在文中注明的情况下才补充。使用轨道摇床(InforsHT)，设置110-120 rpm，37℃，5%CO2条件下于摇瓶中悬浮培养。通过自动细胞计数器（Cedex Automated Cell Counter或Nucleocounter®nc-200™）或血球计数板和赤藓红B进行细胞计数。当细胞密度达到2×10 6个/ mL时，进行规律传代。

2.2 产生稳定的生产细胞系HEK293SF-LVP-CMVGFPq-92（克隆92）并诱导LV产生

根据制造商建议，使用maxiprep试剂盒(Chiagen)纯化质粒。先前已经阐述通过一步法获得构建HEK293SF-LVP-CMVGFPq-92所使用的包装细胞系（即，所有LV组分在一次转染中同时加入）14。为了构建clone 92，使用Lipofectamine 2000试剂（Life Technologies）与经StuI 线性化的pCSII-CMV5-GFP质粒和经Xho1线性化的编码杀稻瘟菌素的抗性的pCDNA6-hisA (Life Technologies) 质粒共同转染在补充有1％FBS（Hyclone）的LC-SFM培养液（Life Technologies）中培养的包装细胞系（clone 29-6），上述两种质粒质量比（μg/μg）为7：1。转染两天后，向培养液中加入7μg/ mL杀稻瘟菌素（InvivoGen），直至产生具有抗杀稻瘟菌素细胞库（约三周）。然后使用不含有杀稻瘟菌素的培养液在96孔板中有限稀释，并进行亚克隆。筛选克隆细胞并首次分析GFP的表达。将具有高水平GFP表达的克隆株扩增并通过加入1μg/ mL多西环素和30μg/ mL的cumate诱导细胞观测慢病毒的产生。从最稳定的生产克隆株中选取一株（clone 92），并在补充有4mM谷氨酰胺的SFM4Transfx-293无血清培养基（Hyclone）中适应性培养。研究细胞库在补充有10％DMSO（Sigma）的相同培养基中制备。

2.3 clone 92的稳定性研究

将clone 92在SFM4TransFx-293中解冻，并接种在含有20mL培养液的125mL摇瓶中。在解冻后2、6、10周时，在1×106个/mL细胞密度下诱导产生慢病毒载体。在48后，经离心澄清，收集含有慢病毒载体的上清液，并添加1%胎牛血清（保护剂），然后冻存在-80℃。采用基因转移法测定上清液中慢病毒载体滴度（2.6节）。

2.4 慢病毒载体在摇瓶中的生产