看够了免疫组化DAB棕褐色显色，换点不同的？

作者：杨超月

小赛之前跟大家聊过免疫组化发展史，其发展的动力在于解决一个又一个临床问题，不断完善的免疫组化犹如插上了翅膀，在医学的广阔天地大有作为（回顾前文：；免疫组化发展史 — 染色方法大盘点）。

当前应用的免疫组化多是使用DAB显色，染色结果呈现棕褐色，今天小赛就跟大家聊一聊免疫组化红色显色。看其想解决什么样的临床问题。 HRP酶标记显色 辣根过氧化物酶（HRP）的常用显色剂为DAB或3-氨基-9-乙基咔唑（AEC）。DAB显色为褐色产物，AEC显色为醇溶性红褐色产物（HRP/AEC光稳定性差，在光照下褪色）。

二氨基联苯胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB）是过氧化物酶的显色底物，是HRP常用的电子供体，在过氧化氢的存在下失去电子，迅速改变颜色，通过聚合等反应，生成不溶性有色颗粒，并就地原位沉淀。显色反应原理如下：

HRP＋H2O2+DAB（电子供体）→HRP＋H2O＋氧化型DAB↓

DAB显色示意图

（注：DAB有致癌作用，操作时应戴手套，尽量避免与皮肤接触）

AP酶标记快红显色 DAB 显色剂的一个优点是，可以将其与有机封片剂一起使用，有机封片剂的折光率往往更好，获得的图像更清晰，因此在免疫组化使用中大放异彩，但有些临床场景中却存在局限性。比如在黑色素瘤免疫组化诊断中，用DAB显示的棕褐色沉淀与黑色素瘤表达的HMB45（或S-100）在颜色上不易区分，若黑素颗粒较多,结果判断较困难。因此明确指出：在富含黑色素的肿瘤中，使用红色显色剂有助于更清晰的帮助判断阳性着色。

黑色素瘤组织MelanA AP-red染色（图片来源：赛诺特生物）

快红显色化学反应原理示意图如下：

快红显色示意图

双染

随着临床需求越来越多，比如在同一张玻片上染色＞两种的颜色，这时候就可以选择使用HRP酶/AP酶组合，通过底物搭配，实现同一张片子染色大于两种的结果。

双染原理示意图多色免疫组化染色现已广泛应用，如现在常见的应用于宫颈癌诊断的p16/ki-67双染，前列腺癌双色三靶标染色；

宫颈癌 p16（棕）/ kI-67（红）双染（图片来源：赛诺特生物）

前列腺癌AMACR（红）+34βE12/P63（棕）染色（图片来源：赛诺特生物）

知识扩展

DAB为何要现配现用？

在不存在过氧化物酶的情况下，DAB 也可与过氧化氢发生缓慢反应，这意味着一旦 DAB 与过氧化氢结合，应相对快速地使用，以避免在溶液中产生棕色沉淀，可能导致背景非特异染色。因此，常规DAB染色的试剂盒配有浓缩的 DAB 底物和含有过氧化氢的单独缓冲液，在使用前现配现用。

DAB为啥有不同颜色？

金属离子可以对二氨基联苯胺（DAB）沉淀的颜色修饰，比如常见的金属离子镍、钴和铜溶液等可以改变通常为棕色的二氨基联苯胺 (DAB) 反应的颜色。颜色分别为紫蓝色 (NiCl2)、深蓝色（CoCl2）、灰蓝色 (CuSO4)。因此，可通过使用不同DAB配方，实现想要的染色效果或多重染色[1]。

HRP/AP常见底物

参考文献：

[1] ions and itsapplication for double immunohistochemistry. J Histochem Cytochem. 1982Oct;30(10):1079-82. doi: 10.1177/30.10.6182185. PMID: 6182185.